1、MERS-CoV 感染恒河猴臨床觀察

MERS-CoV攻毒后，恒河猴表現(xiàn)了一定的感染癥狀，主要表現(xiàn)為攻毒后體溫出現(xiàn)瞬時(shí)升高，即感染后1天、2天體溫急劇上升，但3天時(shí)恢復(fù)正常（圖1）。并且恒河猴在攻毒后飲水量減少，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)恒河猴體重并未有明顯的變化，也沒出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對(duì)攻毒后恒河猴進(jìn)行了血常規(guī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)攻毒后1天，白細(xì)胞有瞬時(shí)升高，但3天時(shí)就恢復(fù)正常。另外還進(jìn)行了肝功能和腎功能檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒前后并未發(fā)生改變。對(duì)照組恒河猴無任何臨床癥狀。

2、MERS-CoV感染恒河猴病理學(xué)檢查

MERS-CoV感染前和感染后3天和5天分別進(jìn)行了肺部X光拍攝，感染前肺部并未觀察到任何變化，感染3天時(shí)肺右下出現(xiàn)陰影，表明肺部有炎癥反應(yīng)。5天時(shí)陰影面積有所減小，但仍存在（圖2A）。MERS-CoV感染后3天，大體解剖可見恒河猴肺部有不同程度充血呈暗紅色，其位置跟X光檢查結(jié)果一致（圖2B）。而對(duì)照組肺部無明顯變化。顯微病理檢查可見攻毒組恒河猴出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為肺泡隔中度到重度增寬，以支氣管為中心發(fā)生灶狀實(shí)變，其中大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主，少量嗜中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞；血管淤血，伴有出血；支氣管管腔中可見少量滲出和紅細(xì)胞，而對(duì)照組無此變化（圖3）。肺外其它組織未見明顯的病理改變。免疫組化分析表明攻毒組恒河猴肺和氣管中可檢測(cè)到病毒蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布在Ⅰ型、Ⅱ型肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。肺外器官并未檢測(cè)到病毒蛋白的存在。對(duì)照組猴肺中并未檢測(cè)到病毒特異蛋白的存在（圖4）。

3、qRT-PCR方法檢測(cè)拭子和組織樣品病毒載量

攻毒后分別對(duì)拭子樣品和組織樣品進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后僅在肺部和氣管檢測(cè)到高的病毒載量，特別是攻毒后1天時(shí)，咽拭子也檢測(cè)到了較高的病毒載量。而在其它組織和其它時(shí)間點(diǎn)拭子檢測(cè)不到病毒核酸或很低的病毒載量存在。對(duì)照組恒河猴組織和拭子樣品未檢測(cè)到病毒核酸的存在（圖5）。

4、 拭子和組織樣品中病毒滴度測(cè)定

對(duì)采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，并未

分離到病毒，與PCR檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果一致。攻毒后3天，采集的組織樣品也進(jìn)行

病毒分離，只在肺部和氣管分離到病毒，肺部病毒滴度達(dá)101.67 TCID50/ml，氣管病毒滴度達(dá)101.5 TCID50/ml。其他器官（腎臟、大腦、心臟、肝臟、脾臟和腸）并未分離到病毒。對(duì)照組恒河猴拭子和組織樣品均未分離到病毒。

5、 MERS-CoV 感染后血清中和抗體檢測(cè)

攻毒后7天、14天、21天和28天，采集感染組和對(duì)照組恒河猴血液，分離血清進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。微量中和試驗(yàn)結(jié)果顯示感染組恒河猴在攻毒后7d即可檢測(cè)到中和抗體的存在，在感染后14d時(shí)達(dá)到高峰，可達(dá)1：320，之后抗體滴度稍微有所下降，在攻毒后28d時(shí)達(dá)到1：160。對(duì)照組血清中檢測(cè)不到中和抗體的存在。

實(shí)驗(yàn)用恒河猴在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傳代三次以上，遺傳背景明確，年齡為1-3歲。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清學(xué)檢查證明抗MERS抗體陰性。恒河猴在生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，并按國(guó)家動(dòng)物生物安全標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。

MERS-CoV(hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷蘭伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Ron Fouchier 教授饋贈(zèng)。采用支氣管鏡輔助攻毒，攻毒劑量為6.5×107TCID50/1ml/只。

觀察攻毒后恒河猴臨床癥狀，每天兩次。分別于攻毒前1d和攻毒后3d、5d

進(jìn)行肺部X光拍攝。攻毒后3天，MERS-CoV攻毒組安樂死2只恒河猴，對(duì)照組安樂死1只，采集肺、氣管、心、脾、腎、腦、肝臟、腸組織進(jìn)行病理、免疫組化和病毒檢測(cè)。攻毒后分別在1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 21和28天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子進(jìn)行病毒檢測(cè)。并且在攻毒后7, 14, 21和28天采集血液分離血清，進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。

2012 年6 月埃及病毒學(xué)家Zaki 從沙特一位患有急性肺炎并伴發(fā)急性腎衰竭的男性患者中分離到了一株冠狀病毒。隨后他把病毒樣本送到了荷蘭鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（Erasmus Medical Center），Ron Fouchier 教授最終證實(shí)的確是一種以前沒有見過的冠狀病毒，命名為 HCoV-EMC，是一種不同于SARS 冠狀病毒(SARS-CoV)的新型冠狀病。

隨后英國(guó)的科學(xué)家也確認(rèn)了一名來本國(guó)就醫(yī)的卡塔爾患者也感染了這種新型冠狀病毒，癥狀亦是嚴(yán)重呼吸綜合征，將該病毒命名為人冠狀病毒-England 1( human coronavirus England 1)。后續(xù)經(jīng)證實(shí)兩病例感染的病毒為同一病毒，序列比對(duì)有99.5%的相似性。

2012 年9 月23 日，世界衛(wèi)生組織發(fā)布公告，確認(rèn)有2 名患者感染了新型冠狀病毒，兩人臨床表現(xiàn)為急性呼吸道感染，并伴有急性腎衰竭。此后幾個(gè)月該病毒在中東地區(qū)接連出現(xiàn)，并出現(xiàn)了小群體傳播事件。另外一些歐洲、美洲、非洲國(guó)家也出現(xiàn)來自中東的輸入病例，分離的毒株也越來越多，并各自命名，比如

humanbetacoronavirus 2CJordan-N3、humanbetacoronavirus 2c England-Qatar 等。為統(tǒng)一新型冠狀病毒名稱，方便新型冠狀病毒感染病例的通報(bào)，2013 年5月國(guó)際病毒分類委員會(huì)冠狀病毒研究小組將此新型冠狀病毒命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)。

據(jù)WHO 報(bào)道該病的潛伏期為2-15天。臨床表現(xiàn)以急性呼吸道感染為主要癥狀。發(fā)病快、高熱、體溫可達(dá)39-40℃，伴有畏寒、寒戰(zhàn)，咳嗽、胸痛、頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)酸痛、乏力、食欲減退等癥狀。在肺炎基礎(chǔ)上，臨床病變進(jìn)展迅速，很快發(fā)展為呼吸衰竭、ARDS 或多器官功能衰竭（MODS），特別是腎功能衰竭，危及生命，少數(shù)病例病情相對(duì)較輕。患者還可能出現(xiàn)消化道癥狀，如腹瀉和胃部不適等；有些患者還會(huì)發(fā)生膿毒性休克，導(dǎo)致死亡。免疫力低下、老年人和伴有慢性病（如糖尿病、癌癥和慢性肺部疾病）的人群更易發(fā)展為重癥。

影像學(xué)表現(xiàn)：胸部X 光片的結(jié)果和局限性肺炎、ARDS 的結(jié)果一致，如雙側(cè)肺門浸潤(rùn)，單側(cè)或雙側(cè)片狀增厚、分割或肺葉混濁，毛玻璃樣外觀，胸膜積液等。下部肺葉比上部肺葉受損程度更大。CT 掃描則顯示間質(zhì)性浸潤(rùn)和實(shí)病。患者通常表現(xiàn)為白細(xì)胞減少，尤其是淋巴細(xì)胞減少。另外患者的血、尿及糞便中均能檢測(cè)到病毒RNA，但遠(yuǎn)少于呼吸道內(nèi)的病毒量，且上呼吸道中的病毒量通常也比下呼吸道量少。在一些病患中發(fā)現(xiàn)有其它呼吸道病毒共感染，在機(jī)械通氣的病患中也出現(xiàn)醫(yī)院獲得性細(xì)菌感染。