給予動(dòng)物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著性延長，避暗錯(cuò)誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 開場實(shí)驗(yàn)

a) 總路程（total distance）：動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的物理位移累積。

b) 速度（speed）：動(dòng)物在單位時(shí)間產(chǎn)生的物理位移。 5 min內(nèi)正常動(dòng)物總路程多為1000 cm -2500 cm，速度為3 cm/s -8 cm/s。動(dòng)物出現(xiàn)抑郁行為時(shí)，速度減少。

c) 運(yùn)動(dòng)總時(shí)間（total move time）：動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)生物理位移時(shí)所需的時(shí)間累積。正常動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)間多大于檢測時(shí)間的30%；抑郁行為判斷標(biāo)準(zhǔn)：與對照組相比有顯著性減低（P <0.05）。

d) 站立次數(shù)（number ofstanding）：動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間內(nèi)的站立總次數(shù)。10 min檢測時(shí)間，正常組大鼠站立次數(shù)20次-50次。10 min檢測時(shí)間，正常組小鼠站立次數(shù)60次-130次，抑郁行為判斷標(biāo)準(zhǔn)：與對照組相比有顯著性減低（P <0.05）。

圖3 大鼠嗅球切除對動(dòng)物開場實(shí)驗(yàn)的影響（sham 空白組；OBX 嗅球切除組；OXB+Flu 繡球切除+氟西汀）

2. 嗅球切除對動(dòng)物強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響

評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)采用動(dòng)物不動(dòng)、攀爬、游泳三類動(dòng)作的時(shí)間及次數(shù)進(jìn)行判定。

a)?不動(dòng)（immobility）：動(dòng)物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有輕微的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。不動(dòng)時(shí)間越長表明抑郁程度越重。正常小鼠不動(dòng)時(shí)間在檢測時(shí)間的40%-80%內(nèi)；正常大鼠不動(dòng)時(shí)間在檢測時(shí)間的30%-70%內(nèi)；抑郁行為判斷標(biāo)準(zhǔn)：不動(dòng)時(shí)間與對照組相比顯著性增加（P <0.05）。

b)?游泳（swimming）：動(dòng)物進(jìn)行流暢、協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)，動(dòng)物四肢始終在水面以下。游泳時(shí)間和游泳距離越少，表明抑郁程度越重。

c)?攀爬（climbing）：動(dòng)物四肢強(qiáng)有力伸出水面，并沿測試箱壁做劇烈的上下動(dòng)作。5 min檢測期內(nèi),SD大鼠攀爬時(shí)間60s -130 s。攀爬時(shí)間越少，表明動(dòng)物抑郁程度越重。

圖4 大鼠嗅球切除對動(dòng)物強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響（sham 空白組；OBX 嗅球切除組；OXB+Flu 繡球切除+氟西汀）

雄性大鼠，體重300-350g，SD大鼠應(yīng)用最廣泛。

1. 藥品與試劑

水合氯醛（或其它麻醉藥物如戊巴比妥鈉）；無菌生理鹽水（或PBS或雙蒸水）；H2O2溶液；吸收性明膠海綿；青霉素鈉粉；云南白藥；乙醇。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器 腦立體定位儀；電動(dòng)磨鉆；自制探針；真空水泵；手術(shù)器械。

3. 實(shí)驗(yàn)方法

在手術(shù)前1周內(nèi)，每日對大鼠進(jìn)行2次撫摸以減少應(yīng)激。術(shù)前給予水合氯醛（400mg/kg，ip）麻醉大鼠，在兩耳聯(lián)線中點(diǎn)處將皮膚切開，暴露顱骨，在距前囟前8 mm，與正中縫兩側(cè)旁開2 mm的交點(diǎn)處，分別用電動(dòng)磨鉆將顱骨鉆兩個(gè)直徑2 mm的小孔，用自制探針攪動(dòng)破壞嗅球后，再用真空泵將破壞的嗅球組織吸出。將吸收性明膠海綿填入小孔止血。假手術(shù)大鼠采用相同的手術(shù)方法，但在手術(shù)定位點(diǎn)上鉆孔后不損傷嗅球。術(shù)后采用75 %乙醇-云南白藥混合劑涂抹傷口，并肌注青霉素鈉（40000U/ml），連續(xù)注射4 d，以防術(shù)后感染。嗅球切除術(shù)后大鼠需恢復(fù)14 d，恢復(fù)階段每日撫摸大鼠以減少應(yīng)激性，14天后方可進(jìn)行藥物處理及行為學(xué)測試。行為學(xué)測試主要包括開場實(shí)驗(yàn)、蔗糖飲水實(shí)驗(yàn)、被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)等。

圖1 大鼠嗅球解剖位置示意圖

4. 注意事項(xiàng)

（1）大鼠體重會(huì)影響嗅球解剖位置的定位坐標(biāo)；

（2）術(shù)前、術(shù)后的撫觸可有效減少大鼠的應(yīng)激反應(yīng)；

（3）手術(shù)過程中應(yīng)盡量減少出血；

（4）行為學(xué)測試結(jié)束后，每只動(dòng)物需檢查嗅球和前額葉皮層位置，對于嗅球切除體積低于70%或損傷前額葉皮層的動(dòng)物，數(shù)據(jù)應(yīng)剔除。

圖2 大鼠嗅球切除前后對比（A嗅球切除前；B嗅球切除后）

抑郁癥是一種嚴(yán)重影響人體健康的精神疾病，其患病率約占總?cè)丝诘?%。世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2020年抑郁癥將成為第二大主要疾病之一，給社會(huì)帶來極大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，抑郁癥已成為全世界共同面臨的衛(wèi)生健康難題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性生活事件是抑郁癥的顯著促發(fā)因素，引發(fā)抑郁的主要原因是來自慢性、低強(qiáng)度、長期的日常壓力。

目前，抑郁癥尤其是中重度抑郁癥的主要治療手段仍是藥物治療。20多年以來，隨著人們對抑郁癥機(jī)制研究的深入，抗抑郁藥物的研究開發(fā)也取得了極大進(jìn)步。由于合成抗抑郁藥大多存在抗抑郁譜窄、不良反應(yīng)大、藥價(jià)高和易復(fù)發(fā)等缺陷，人們逐漸把目光投向傳統(tǒng)的中醫(yī)藥。傳統(tǒng)藥物和天然藥物作為抗抑郁候選藥物的研究開發(fā)已日漸成為國內(nèi)外的熱點(diǎn)。

大鼠嗅球切除模型屬于腦損傷抑郁模型，模型動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)和病理生理改變與抑郁癥患者吻合，抗抑郁藥物在該模型中敏感，且一般需要慢性給藥才能發(fā)揮抗抑郁作用，與臨床起效時(shí)程一致。大鼠嗅球切除模型是目前評(píng)價(jià)化合物是否具有抗抑郁作用的常用抑郁動(dòng)物模型。