1. 動物癥狀觀察與野生型斑馬魚相比，斑馬魚幼體暴露于 MPTP 后，出現類似人類 PD 患者的行走不穩、反應遲緩、靜止性震顫。PD 模型斑馬魚的游泳速度明顯變緩，泳速和游泳持續時間明顯減低，甚至靜止時伴有身體抖動，對觸及刺激反應遲緩且反應強度減低（圖 1）。與臨床癥狀相符。

2. 生物標志物方面：PD 的蛋白標志物 β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1 明4顯高于正常對照斑馬魚；神經元細胞標志物酪氨酸羥化酶蛋白(TH)明顯減少，提示多巴胺能神經元細胞死亡數增多（圖 1）。

3. 多巴胺能神經元細胞數量明顯減少。但，神經元細胞內 th 基因表達強度增強，類似于人 PD 早期腦多巴胺神經元死亡后存活神經元的代償性 TH 高表達。（圖 2）

圖1. MPTP造成斑馬魚幼體運動減少，PD標志基因/蛋白水平升高斑馬魚幼體(5 dpf)暴露于50 μM的MPTP中24小時，進行運動活性（運動距離、持續時間和速度）檢測20分鐘。A．散點圖顯示幼體運動行為的統計學變化；右側顯示一組代表性運動軌跡圖(5分鐘軌跡)。B–E, 斑馬魚暴露于100和200 μMMPTP 24小時后，檢測PD相關的標志基因和蛋白: TH (B)、β-syn (C)、Parkin (D)和PINK1 (E)。*, p values_0.05; **, p values_0.01; ***, p values_0.001。(one-wayANOVA)。

圖 2. MPTP 導致斑馬魚幼體中腦多巴胺能神經元數量減少A. 以酪氨酸羥化酶基因(th)反義 RNA 為探針，采用原位雜交方法檢測斑馬魚幼體中腦多巴胺神經元數量和 th 基因表達強度。B. 原位熒光免疫實驗檢測酪氨酸羥化酶，綠色熒光斑點顯示斑馬魚幼體中腦多巴胺神經元數量和分布。一抗抗體為酪氨酸羥化酶抗體。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

（1） 癥狀觀察斑馬魚幼體（6 dpf）行為: 考察、記錄其游泳速度和姿態、持續時間、運動距離；靜止時身體平衡情況、有無顫抖等。

（2） 生物標志物檢測斑馬魚暴露于 MPTP 中持續 24 小時，收集幼體，提取總 RNA 和蛋白，進行 RT-PCR 和 Western blotting 檢測 PD 相關的基因和蛋白：TH、β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1。

（3） 病理診斷采取原位雜交和原位免疫熒光方法，檢測斑馬魚中腦/間腦多巴胺神經元的數量和分布變化。

1. 造模化合物1-甲基－4－苯基－1,2,3,6－四氫吡啶（MPTP）是一種神經毒素，常用于制作帕金森病動物模型。2. 實驗動物野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系。斑馬魚飼養和管理均按照常規方法。飼養空間溫度 28-30°C。3. 造模化合物處理MPTP 為 Sigma (M0896) 產品，MPTP 母液用純水制備，濃度為100 μM，儲存于－20 °C. MPTP工作液用飼養液稀釋至50、100、200、500 μM。將斑馬魚2幼體暴露于MPTP 工作液24小時，收集幼體，進行下一步處理。4. RT-PCR檢測PD相關基因轉錄水平

收集斑馬魚于 TRIzol reagent (Sigma).提取總 RNA，進行 RT-PCR 檢測 PD相關的基因表達水平。PCR 引物見表 1。

5. 原位RNA雜交收集斑馬魚于4% paraformaldehyde固定。Th基因探針片段為PCR產物（表1），并被克隆到載體pGEM-T質粒上。探針的合成按照試劑盒(DIG RNA labeling kit(Roche Applied Science, 1175041)）說明制備th基因RNA雜交探針。按照操作程序將斑馬魚樣本與探針溫育、檢測、拍照。

6. 原位免疫熒光檢測按照常規程序，將斑馬魚幼體與TH蛋白單克隆抗體(Minipore, MAB318)溫育，然后用FITC-標記的二抗溫育、洗滌，顯微鏡下檢測、拍照。

7. Western blotting用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑馬魚總蛋白，進行SDS-PAGE、轉膜，用PD相應蛋白的抗體和二抗進行檢測。β-ACTIN抗體，3mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonalantibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no.6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAbantibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑馬魚行為學實驗幼體行為記錄采用ZebraLab (法國Viewpoint, ZebraLab 3.3)儀器，幼體逐個放入96-孔板，(1 fish/well). 記錄運動距離、游泳持續時間、速度和游泳軌跡。每5分鐘記錄一次數據。

一、疾病名稱 帕金森疾病 (Parkinson’s disease, PD)二、臨床發病機制及癥狀 帕金森疾病是中老年人的慢性神經系統退行性疾病，發病年齡在 40－70 歲之間。PD 發病與以下因素相關：1.腦老化，隨人的增齡，黑質多巴胺能神經元不斷死亡，當 80％的神經元死亡時可出現 PD 癥狀。2. 具有遺傳性，a-突觸核蛋白及 Parkin 等基因突變與少數家族性 PD 相關。3.環境因素，一些外源性或內源性毒素可引起黑質紋狀體神經元死亡，如海洛因吸食者出現 PD 樣癥狀，后者被證實含有神經毒素 MPTP。4. 其它疾病和外傷導致的腦神經損傷，如腦梗等腦血管病變和創傷導致的腦神經元死亡。臨床 PD 主要有 4 大癥狀：靜止性震顫、運動緩慢或少動、肌強直及姿態平衡障礙。