Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
討論與結論
目前Nipsnap2蛋白及其所屬的Nipsnap蛋白家族功能的研究較少，其模型中的作用未見報道，該項目屬于原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。此模型的建立為研究該基因提供了依據(jù)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在動物水平上，敲除Nipsnap2基因，對心肌肥厚病理進程有顯著的加重作用。通過對Nipsnap2基因功能的深入研究，將明確NIPSNAP2在心肌肥厚過程中調控代謝的分子機制，為通過代謝重塑臨床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的實驗證據(jù)及分子靶點。
生物安全性
模型動物飼養(yǎng)在武漢大學人民醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。
（1）建筑特點
門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統(tǒng)內共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機房和配電室等。
（2）設計參數(shù)
室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。
（3）通風和空調系統(tǒng)
動物實驗室采用全新風中央空調通風系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環(huán)境。
（4）照明系統(tǒng)
一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養(yǎng)室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據(jù)實際需要，調節(jié)控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。
（5）通訊系統(tǒng)
因為SPF級動物實驗室的環(huán)境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯(lián)系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機保持聯(lián)系，保證實驗室內外信息的及時溝通。
（6）監(jiān)控系統(tǒng)
對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態(tài)；也能有效督促實驗人員執(zhí)行科學的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內環(huán)境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態(tài)和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。
（7）供水系統(tǒng)
SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。
（8）供電系統(tǒng)、警報系統(tǒng)和消防設施
SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導致環(huán)境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統(tǒng)，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。
（9）消毒滅菌設備
為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環(huán)境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。
（10）動物飼養(yǎng)籠具
飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環(huán)境的清潔。
（11）墊料的選擇和使用
在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。
（12）飼料配制
大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養(yǎng)成分指標，保證飼料的質量。
評價驗證
圖1. Nipsnap2敲除鼠鑒定結果圖雜合子：雙帶，其中一條帶是缺失200bp；純合子：單條帶，兩條帶均缺失200bp。 2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所誘導的心肌肥厚水平 TAC手術四周后，Nipsnap2敲除鼠的心臟重量相比于sham組顯著增大，左心室后壁厚度增加，并且在心肌肥厚進程加重（圖2A-E）。心臟超聲檢測小鼠心臟結構和功能發(fā)現(xiàn)，敲除Nipsnap2后，加重了TAC手術導致的心肌肥厚，主要表現(xiàn)為左心室射血功能EF和FS的影響（圖2D-E）。取各小組小鼠的心臟組織提取總RNA，結果如圖2I-J所示，TAC手術后小鼠心肌肥厚標志物Anp和Bnp表達水平顯著升高，Nipsnap2敲除后加重了這樣的變化。
圖2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所誘導的心肌肥厚水平
A-B．敲除Nipsnap2基因對小鼠心臟結構改變：A.小鼠心臟示意圖；B.小鼠心臟整體重量與體重比值分析；
C-H．心臟超聲檢測Nipsnap2基因敲除小鼠心臟功能改變：C.TAC術后四周小鼠M型超聲心動圖；D.心臟超聲檢測的EF值結果；E.心臟超聲檢測的FS值結果；F. LVPWd (mm)為左心室舒張末后壁厚度；G.IVPWs(mm)；H.IVIDd (mm) ；
I-J．QPCR檢測心肌肥厚的標志物Anp和Bnp在mRNA水平變化：I.Anp；J.Bnp。
Sham:假手術組；TAC：TAC手術組；WT：野生型小鼠；KO：Nipsnap2敲除鼠；*：p<0.05.
制備方法
1. 利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現(xiàn)靶位點堿基序列缺失，實現(xiàn)基因敲除。guide RNA設計：
guideRNA信息:
· Nipsnap2（ko） -sgRNA1： TTGTCAGAAAGGTCGATCCAAGG
· Nipsnap2（ko） -sgRNA2： TTCAGTTCACAACGTTAAGCCGG
2. 建立主動脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手術），通過超聲心動圖評價心臟功能，小鼠采用異氟脘吸入麻醉，將小鼠左胸前區(qū)剃毛，涂抹耦合劑，取仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀（VET V6，VINNO，中國），頻率為12.5MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量各項指標。
3．小鼠心臟組織切片形態(tài)及病理檢測 稱取小鼠體重，小鼠經(jīng)心臟灌注，取出心臟后用濾紙吸干血液后稱重，計算心臟重量與體重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。
4．心肌肥厚分子標志物檢測將各實驗組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應用qPCR檢測心肌肥厚指標Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。
研究背景
模型信息
中文名稱:Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
英文名稱:Mouse model of Nipsnap2 gene knockout cardiac hypertrophy disease
類型:心肌肥厚動物模型
分級:NA
用途:為通過代謝重塑臨床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的實驗證據(jù)及分子靶點。
研制單位:武漢大學
保存單位:武漢大學
