Isca1是最近發(fā)現(xiàn)的多發(fā)性線粒體功能障礙綜合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究發(fā)現(xiàn)Isca1在線粒體以及胞質(zhì)鐵硫簇生物合成過(guò)程中起重要作用，而鐵硫簇最重要的生物學(xué)功能是作為電子傳遞蛋白的輔助基團(tuán)參與能量轉(zhuǎn)移。

所以推測(cè)Isca1基因?qū)C(jī)體線粒體功能及能量代謝進(jìn)程具有重要作用，而心臟作為機(jī)體內(nèi)重要高耗能臟器，Isca1基因?qū)π呐K發(fā)育，能量代謝及病理進(jìn)程可能具有重要作用。

然而，目前還沒有該基因心肌特異性敲除大鼠模型的建立及研究報(bào)道，所以特構(gòu)建該模型大鼠，以分析Isca1基因?qū)π呐K發(fā)育的影響及其生物學(xué)功能，為新的心肌能量代謝異常和由心肌線粒體功能障礙導(dǎo)致的心衰大鼠模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

已構(gòu)建成功的心肌特異性敲除純合子大鼠模型，出生后7-10天即陸續(xù)死亡，至出生后11天生存率為0%，至6.5天時(shí)小鼠心臟整體擴(kuò)張嚴(yán)重，心功能下降顯著，表現(xiàn)為嚴(yán)重心衰癥狀，心肌纖維斷裂溶解，心肌線粒體腫脹，嵴消失，空化嚴(yán)重。推測(cè)該模型大鼠由Isca1基因缺失后導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而引發(fā)心衰及死亡。

該模型對(duì)于Isca1基因的生物學(xué)功能研究，特別是其對(duì)心肌線粒體功能的影響及機(jī)制分析提供了工具動(dòng)物，并且可成為由心肌線粒體功能障礙導(dǎo)致心衰的工具動(dòng)物模型。但是該動(dòng)物模型發(fā)病較早，限制了部分實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和后續(xù)研究。

SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003.

4.1 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型的建立

利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行條件性敲除（Conditionalknockout，CKO），制備心肌組織特異性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外顯子兩端插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建Isca1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)兩輪雜交最終獲得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通過(guò)PCR方法進(jìn)行基因型鑒定心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型。免疫印跡Westernblot方法鑒定Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠ISCA1蛋白的敲除效率達(dá)90%以上（圖3）。

圖3 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型基因型鑒定及基因蛋白表達(dá)水平鑒定

4.2 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠生存率分析

為觀察心肌組織特異性Isca1敲除大鼠子代基因型及生存率情況，將 Isca1flox/+大鼠與MHC-Cre大鼠經(jīng)兩代雜交，得到野生型（WT）、心肌特異性Isca1敲除大鼠雜合子（Isca1flox/+/MHC-Cre）和心肌特異性Isca1敲除大鼠純合子（Isca1flox/flox/MHC-Cre）幼崽，根據(jù)孟德爾定律，上述基因型比例應(yīng)為5：2：1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，累積統(tǒng)計(jì)幼崽共127只，其中WT幼崽74只，Isca1flox/+/MHC-Cre 幼崽37只，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽16只，經(jīng)計(jì)算可得子代中野生型、雜合子型、純合子型三種基因型幼崽出生比例基本符合孟德爾定律（圖4）。對(duì)三種基因型子代進(jìn)行生存率分析顯示，子代中WT和Isca1flox/+/MHC-Cre幼崽生存正常，生存率為100%，Isca1flox/flox/MHC-Cre幼崽7~10天全部死亡，至11天生存率為0%（圖4）。

圖4 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠生存率分析

注：（A）Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交后，出生子代基因型情況統(tǒng)計(jì)。（B）Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交后，WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre子代生存率統(tǒng)計(jì)。

4.3 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心臟重量/體重比分析

使 Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠雜交，于子代出生后6.5天對(duì)WT和Isca1flox/flox/MHC-Cre（CKO）子代進(jìn)行大體形態(tài)觀察并計(jì)算心臟重量與體重之比（heartweight/body weight，HW/BW）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與野生型相比，6.5 d CKO大鼠呼吸虛弱，處于瀕臨死亡狀態(tài)（圖5），并且心臟外觀出現(xiàn)明顯肥大。6.5d CKO大鼠HW/BW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（8.11± 1.85）mg/g，較6.5d WT大鼠（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（6.50± 1.01） mg/g）顯著增加，有顯著性差異（圖5，*P<0.05）。

圖 5 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠HW/BW比率分析

4.4 M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)6.5 d心肌特異性Isca1敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能

為分析心臟結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)改變，本研究通過(guò)M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)6.5d 野生和心肌組織特異性敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能。發(fā)現(xiàn)與同窩WT大鼠相比，6.5dKO大鼠射血分?jǐn)?shù)大幅下降，左心室內(nèi)徑明顯增大，伴隨室壁變薄，表現(xiàn)為收縮無(wú)力，心室嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，已出現(xiàn)心功能下降、嚴(yán)重心衰的癥狀。

注：左心室舒張末期內(nèi)徑（leftventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVID;s）；射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）；短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）；舒張期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; diastolic，LVPW;d）；收縮期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; systolic，LVPW;s）；舒張期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；收縮期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; systolic，LVAW;s）。*P<0.05，**P<0.01，versus同窩WT大鼠。

4.5 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心肌纖維及線粒體形態(tài)觀察

為進(jìn)一步分析心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心肌纖維和線粒體形態(tài)改變，取6.5天WT和心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，摘取心臟，取左心室2mm×2 mm大小新鮮組織，使用電鏡專用固定液進(jìn)行固定，制備電鏡樣本并進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，WT大鼠心肌纖維排列整齊，肌節(jié)和Z線清晰，心肌內(nèi)線粒體多呈圓形或橢圓形，線粒體雙層膜膜結(jié)構(gòu)清晰，嵴致密。而6.5天心肌組織特異性Isca1大鼠敲除心肌纖維出現(xiàn)斷裂，肌節(jié)和Z線嚴(yán)重模糊，部分位置纖維已溶解，心肌內(nèi)線粒體膜結(jié)構(gòu)受損，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失，線粒體腫脹及空化嚴(yán)重（圖6）。

圖6心肌組織特異性Isca1敲除大鼠超微結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003.

3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

3.1.4 模型構(gòu)建流程 利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行條件性敲除（Conditional knockout，CKO），制備心肌組織特異性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外顯子兩端插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建Isca1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)兩輪雜交最終獲得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行敲除效率的鑒定。3.1.5 Isca1條件性敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立3.1.5.1 Isca1條件性敲除大鼠模型的建立

圖 1. Isca1條件性敲除模型構(gòu)建設(shè)計(jì)方案

(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。

靶點(diǎn)1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG

R-ISCA1-gRNAUP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNADOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶點(diǎn)2:

AGCCCTGAACTCCTTATG TGG

R-ISCA1-gRNAUP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNADOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

(3) 合成的sgRNA單鏈通過(guò)退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。

(4) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。

(5) 顯微注射

1) 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。

2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。

3) 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。

4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

(6) 基因型鑒定

1) 剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。

2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

3) PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

(7) 結(jié)果分析：選取通過(guò)PCR檢測(cè)后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號(hào)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。

(8) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定Isca1條件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.5.2 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠（Isca1flox/flox/MHC-Cre）的建立

根據(jù)3.1.5.1獲得Isca1flox/+大鼠F1代后，首先通過(guò)8周齡左右Isca1flox/+與野生型大鼠進(jìn)行雜交，獲得一定數(shù)量的Isca1flox/+大鼠。與此同時(shí)使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與αMHC-Cre大鼠（SD.Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進(jìn)行雜交，得到Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠進(jìn)行第二輪雜交，可得到Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2.Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無(wú)菌的離心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。

(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。

(6) 重復(fù)步驟（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無(wú)水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。

(8) 重復(fù)步驟（7）一次。

(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。

(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

心力衰竭，簡(jiǎn)稱心衰，是指由于心臟收縮和（或）舒張功能障礙，無(wú)法將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)灌注不足，從而引發(fā)心臟循環(huán)障礙癥候群，心衰并不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是所有心血管疾病發(fā)展的終末階段。

近年來(lái)，隨著我國(guó)社會(huì)老齡化和高血壓，冠心病等心血管疾病發(fā)病率的增加，使得心衰呈現(xiàn)高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，《2018中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南》中報(bào)道我國(guó)心衰患病率為0.9%，有1000萬(wàn)左右的心衰患者。

幾乎所有的心血管疾病最終都會(huì)導(dǎo)致心衰的發(fā)生，而在基礎(chǔ)性心臟病的基礎(chǔ)上，一些因素亦可誘發(fā)心衰的發(fā)生，常見誘因包括，感染，嚴(yán)重心律失常，心臟負(fù)荷增大，藥物中毒（如洋地黃）等等。

心衰在臨床上可分為急性心衰和慢性心衰。臨床表現(xiàn)，包括呼吸困難，運(yùn)動(dòng)耐力下降，心室腔增大，心臟功能下降（LVEF<40-50%），心臟順應(yīng)性降低，心室腔內(nèi)淤血，肺循環(huán)及體循環(huán)淤血。

臨床檢查手段，包括超聲影像分析，心電圖，心衰標(biāo)志物（B型利鈉肽（BNP），N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP））心肌壞死標(biāo)志物（心肌肌鈣蛋白T（cTnT）及心肌肌鈣蛋白I（cTnI））。

臨床治療方法，包括強(qiáng)心（米力農(nóng)，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重構(gòu)（卡維地洛）及心臟移植。

二、模型背景

1、xx（細(xì)胞/基因/病原/其他造模因素）信息

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

Isca1是最近發(fā)現(xiàn)的多發(fā)性線粒體功能障礙綜合征（MMDS）的致病基因，目前已有研究發(fā)現(xiàn)Isca1在線粒體以及胞質(zhì)鐵硫簇生物合成過(guò)程中起重要作用，而鐵硫簇最重要的生物學(xué)功能是作為電子傳遞蛋白的輔助基團(tuán)參與能量轉(zhuǎn)移【1-6】。

所以推測(cè)Isca1基因?qū)C(jī)體線粒體功能及能量代謝進(jìn)程具有重要作用，而心臟作為機(jī)體內(nèi)重要高耗能臟器，Isca1基因?qū)π呐K發(fā)育，能量代謝及病理進(jìn)程可能具有重要作用。

目前還沒有該基因心肌特異性敲除大鼠模型的建立及研究報(bào)道，所以特構(gòu)建該模型大鼠，以分析Isca1基因?qū)π呐K發(fā)育的影響及其生物學(xué)功能，為新的心肌能量代謝異常和由心肌線粒體功能障礙導(dǎo)致的心衰大鼠模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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