為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動物模型的制備和應(yīng)用實驗必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

Mbd4基因編碼的蛋白MBD4介導(dǎo)DNA修復(fù)，可能對慢性炎癥組織的致癌作用非常重要。在人類中，MBD4的序列和表達(dá)的改變與癌癥風(fēng)險的升高有關(guān)。MBD4 Glu346Lys多態(tài)性與結(jié)腸直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌的風(fēng)險增加相關(guān)。在小鼠實驗表明Mbd4可以抑制潰瘍性結(jié)直腸炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌小鼠模型的發(fā)病率和死亡率。

F0代構(gòu)建：采用Cas9進(jìn)行基因定點敲入。

Mbd4基因編碼的蛋白質(zhì)是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，包括一個C端單功能胸腺嘧啶-尿嘧啶DNA糖基化酶和一個N端甲基- cpg結(jié)合域（MBD），其甲基- cpg結(jié)合域?qū)⒚付ㄎ挥诨蚪M的富含cpg的區(qū)域，啟動堿基切除修復(fù)(BER)，修正由于5-甲基胞嘧啶(5MeC)或胞嘧啶脫氨產(chǎn)生的T:G或U:G錯配。研究表明，MBD4介導(dǎo)的DNA修復(fù)可能對慢性炎癥組織的致癌作用非常重要。在人類中，MBD4的序列和表達(dá)的改變與癌癥風(fēng)險的升高有關(guān)。MBD4 Glu346Lys多態(tài)性與結(jié)腸直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌的風(fēng)險增加相關(guān)。在一些自身免疫性疾病中也觀察到MBD4的多態(tài)性或表達(dá)改變，這表明MBD4與反常的免疫反應(yīng)之間可能存在聯(lián)系。在小鼠實驗表明Mbd4可以抑制潰瘍性結(jié)直腸炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌小鼠模型的發(fā)病率和死亡率：Mbd4?/?小鼠比野生型小鼠的生存時間更短，死亡時的腫瘤負(fù)荷更大，臨床癥狀更嚴(yán)重。組織病理學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)Mbd4?/?小鼠的炎癥和組織損傷更嚴(yán)重。NPSG小鼠為無T，B及NK細(xì)胞的NPSG重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠，其免疫系統(tǒng)缺陷程度與NSG及NOG小鼠同級，體質(zhì)較強(qiáng)，適用于各類異體移植模型及免疫系統(tǒng)重建模型。