流行病學數(shù)據表明，HPV感染與5%人類癌癥有關。現(xiàn)有HPV疫苗可有效預防大多數(shù)因乳頭瘤狀病毒感染而引起的癌癥，但目前尚無針對HPV感染后引起惡性癌癥的治療方法，因此發(fā)展有效抗HPV治療方法仍是重要的醫(yī)學挑戰(zhàn)。由于乳頭瘤病毒感染具有宿主特異性，HPV只感染人，尚不能自然感染其它動物，這就限制了HPV感染動物模型發(fā)展及發(fā)病機制研究。研究人員通過犬口腔乳頭瘤病毒（Canine oral papillomavirus，COPV）、牛乳頭瘤病毒（Bovine papillomavirus，BPV）及棉尾兔乳頭瘤病毒等進行了乳頭瘤病毒引起的癌癥致病機制研究及疫苗研發(fā)。雖然這些模型已經幫助我們了解這類致癌病毒的感染過程、生命周期和發(fā)病機制以及在疫苗評價方面做出了重要貢獻，但由于這些動物體積較大并且其生物學、遺傳學、免疫學于人類不同以及試劑的有限性等原因限制了對HPV更進一步的研究。2011年印度科學家發(fā)現(xiàn)的鼠乳頭狀病毒可感染實驗室小鼠品系，首次提供在小鼠上研究乳頭瘤狀病毒的機會。

本研究中，NU/NU小鼠尾部感染MmuPV116周后可肉眼觀察到明顯乳頭瘤狀病變，增生組織均能檢測到MmuPV1 DNA。尾部組織病理HE染色觀察可見感染的小鼠尾部鱗狀上皮增生；RNAscope技術是在RNA水平利用靶向特異性雙Z設計探針檢測單鏈RNA的原位雜交，解決了尚無MmuPV1相應抗體檢測及定量的問題。本模型中，MmuPV1感染小鼠尾部皮膚可檢測到明顯E1^E4轉錄本信號。同時將MmuPV1感染增生尾部皮膚與未感染小鼠尾部進行轉錄水平比較分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要與皮膚上發(fā)育、核糖體合成、嘌呤核苷酸代謝等生物進程有關，并且富集到癌癥信號通路、核糖體合成相關信號通路等，說明相關基因與信號通路可能直接或間接參與MmuPV1感染尾部皮膚后病變的發(fā)生。

綜上所述，MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部皮膚增生模型的建立，為HPV感染、致病機制研究以及防治策略等方面提供更多機會。

人乳頭瘤病毒在《人間傳播的病原微生物名錄》中的危害程度屬于第三類。但由于該病毒不能感染動物，科研人員使用小鼠乳頭瘤病毒建立動物參比模型，用于人乳頭瘤病毒感染及致病機制研究。MmuPV1未被收錄《人間傳播的病原微生物名錄》中。MmuPV1和HPV同屬于乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬，由于MmuPV1發(fā)現(xiàn)時間較短，對其研究較為有限，因此，其許多生物學信息可參考HPV的資料。

小鼠乳頭瘤病毒未被收錄《人間傳播的病原微生物名錄》中；但人乳頭瘤病毒在《人間傳播的病原微生物名錄》中的危害程度屬于第三類。為保證實驗室生物安全，防止該病原對實驗動物的感染，本實驗室按照生物安全三類病原進行防范。根據《人間傳染的病原微生物名錄》中對不同類別病原微生物進行實驗要求不同生物安全級別實驗室的解釋，在實驗操作涉及小鼠乳頭瘤病毒的大量培養(yǎng)、離心、凍干等實驗操作以及小鼠乳頭瘤病毒感染的動物實驗應在BSL-2或ABSL-2實驗室進行。對于未經小鼠乳頭瘤病毒培養(yǎng)的感染材料的操作應在BSL-2實驗室進行。對經有效方法滅活后不含小鼠乳頭瘤病毒活病毒材料或無感染性材料的實驗操作可在BSL-1實驗室進行。

1.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1觀察

肉眼觀察可見，感染后4周左右部分小鼠尾部皮膚即出現(xiàn)輕微增生，16周后可觀察到明顯病變（圖1）。

圖1 MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部增生模型

2.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 DNA檢測

MmuPV1感染尾部提取總DNA，利用對MmuPV1 E2基因特異性引物擴增鑒定MmuPV1表達。結果表明， 9只感染MmuPV1的小鼠尾部均建立MmuPV1持續(xù)感染，并可檢測到MmuPV1 DNA（圖2）。

圖2感染小鼠尾部MmuPV1 E2基因PCR鑒定

1-9：MmuPV1感染小鼠尾部DNA；10：MmuPV1質粒（陽性對照）；

11：未感染小鼠尾部DNA（陰性對照）；12：水（空白對照）；

M：Trans 2k Plus DNA Marker

3.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1后的病理學變化

用MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部，16周后出現(xiàn)明顯增生，收集增生部位用10%福爾馬林固定，蘇木精伊紅染色（HE染色）后進行病理分析。組織學觀察可見感染的小鼠尾部表面鱗狀上皮增生（圖3）。因為MmuPV1 E1^E4轉錄本存在于大多數(shù)乳頭瘤病毒早期和晚期轉錄過程，即利用RNAscope原位雜交檢測MmuPV1 E1^E4轉錄本表達，發(fā)現(xiàn)尾部增生部位轉錄本的表達為明顯陽性（棕色）（圖4A），而陰性探針組未檢測到信號（圖4B）。

圖3MmuPV1感染小鼠尾部病變HE染色分析（100X）

圖4 RNAscope原位雜交檢測感染小鼠尾部病變MmuPV1 E1^E4轉錄本

A： RNAscope原位雜交E1^E4轉錄本檢測；B：RNAscope原位雜交陰性探針對照

4.NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1轉錄水平差異表達分析

NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 16周后，尾部增生皮膚（實驗組Tail）及尾部正常皮膚（空白對照組Tail C）差異基因表達分析。結果表明，與對照組比，實驗組有2653個基因表達上調（紅色點），2306個基因表達下調（綠色點），藍色點表示未發(fā)生顯著變化的基因，其中橫坐標表示基因表達的倍數(shù)變化（log2FoldChange），其中絕對值越大表明，與對照組相比，實驗組表達變化倍數(shù)越大；縱坐標表示表達差異的顯著水平，Y軸1.3附近虛線對于Pvalue＝0.05（圖5A）。根據GO富集分析（圖5B），差異基因主要與皮膚上發(fā)育、核糖體合成、嘌呤核苷酸代謝等生物進程有關；將差異基因進行KEGG功能富集到癌癥信號通路、核糖體合成相關信號通路等，說明其可能直接或間接參與MmuPV1感染尾部皮膚后病變的發(fā)生（圖5C）。

圖5MmuPV1感染小鼠尾部轉錄水平差異表達

A：差異表達基因火山圖；B：GO富集分析結果；C：KEGG通路富集分析結果

1.小鼠尾部MmuPV1感染

三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤體重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反復輕輕刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×108 VGE）滴加到刮擦過的尾部。每周觀察2次，待尾部病變直徑接近1cm時，安樂小鼠并收集腫瘤。部分腫瘤組織置于福爾馬林固定液用于組織學研究；部分腫瘤組織置于液氮中速凍，并保存于-80℃進行后續(xù)感染和分子研究。

2.小鼠尾部MmuPV1DNA提取

使用分離柱法分離組織DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）。提取方法如下：將25mg切成盡量小塊置于1.5ml EP管中，加入180μlBuffer ATL及20μl Proteinase K，震蕩混勻，56℃孵育1-3h至增生組織完全裂解，孵育期間間斷震蕩；震蕩15s，加入200μl Buffer AL，震蕩充分混合，加入200μl無水乙醇，再次充分震蕩混勻；混合物轉移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000rpm）離心1min，棄廢液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000rpm）離心1min，棄廢液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000rpm）離心3min，棄廢液；將珠子置于新的1.5ml或2ml離心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室溫靜置1min，≥6000×g（8000rpm）離心1min。

3.小鼠尾部MmuPV1的PCR檢測

將小鼠尾部增生組織置于PBS中，利用勻漿器高速勻漿3min。勻漿液10，000rpm離心3min，將上清液轉移到新1.5ml EP管中。配置反應體系，上下游引物分別為對MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`-GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反應條件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40個循環(huán)；68℃ 10min。

4.小鼠尾部MmuPV1感染組織病理學檢測

安樂小鼠，解剖采集尾部增生部位皮膚，進行蘇木精-伊紅（HE染色）。方法簡述：組織塊經10%的多聚甲醛固定、脫水透明后，置于熔化的石蠟中進行包埋，進而制作石蠟切片；切片脫蠟后進行HE染色；進一步的脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

5.RNAscope原位雜交

安樂小鼠，解剖采集尾部增生部位皮膚置于10%多聚甲醛固定、脫水透明后，置于熔化的石蠟中進行包埋，進而制作石蠟切片，切片進行后續(xù)RNAscope原位雜交，具體實驗步驟如下：

（1）載玻片脫蠟：60℃烤片1h，二甲苯脫蠟2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水紙上，室溫靜置干燥5min；

（2）雙氧水靶標修復：切片滴加約5-8滴RNAscope?雙氧水，室溫孵育10min，蒸餾水清洗切片3-5次后，將載玻片浸沒到煮沸的1×RNAscope?靶標修復液中放置15min，蒸餾水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室溫靜置干燥；

（3）畫疏水圈：使用ImmedgeTM疏水筆在樣本周圍化疏水圈2-4次；

（4）將載玻片置于HybEZTM載玻片架中，滴加5滴RNAscope?蛋白酶plus，放入HybEZTM濕盒，放回40℃雜交爐 30min。蒸餾水洗3次；

（5）探針雜交：載玻片滴加4滴E1^E4探針，再放入濕盒，雜交爐40℃孵育2h，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（6）雜交Amp1：載玻片上滴加4滴Amp1，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（7）雜交Amp2：載玻片上滴加4滴Amp2，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（8）雜交Amp3：載玻片上滴加4滴Amp3，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（9）雜交Amp4：載玻片上滴加4滴Amp4，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（10）雜交Amp5：載玻片上滴加4滴Amp5，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（11）雜交Amp6：載玻片上滴加4滴Amp6，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（12）信號檢測：棄掉液體后，載玻片上滴加120μl DAB工作液，室溫靜置10min，去除DAB工作液，蒸餾水洗3-5次；

（13）載玻片復染：載玻片放入蘇木精染色液中，室溫靜置2min，蒸餾水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸餾水再洗3-5次；

（14）載玻片脫水：載玻片放入70%乙醇，室溫靜置2min，100%酒精，室溫靜置2min，100%酒精，室溫靜置2min，二甲苯溶液，室溫靜置5min；

（15）封片：載玻片風干后，滴加1滴Cytoseal封片劑，蓋上蓋玻片，風干載玻片5min。

6.轉錄組差異分析

TRIzol法提取尾部增生皮膚（實驗組）及尾部正常皮膚（空白對照組）樣本RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop進行RNA濃度和純度檢測。送到北京諾禾致源科技股份有限公司測序平臺進行RNA測序。通過文庫構建并測序獲得原始測序序列后進行信息分析流程，主要由兩個階段：a）評估測序數(shù)據質量；b）信息挖掘及分析。將實驗組與對照組RNA-seq序列進行對比，鑒定分析差異基因表達和聚類分析（包括差異基因數(shù)目統(tǒng)計、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR軟件進行表達差異顯著性分析。

1.病原學

乳頭瘤病毒（Papillomaviruses, PV）為無包膜雙鏈DNA病毒，可感染粘膜和/或皮膚上皮細胞，具有高度宿主特異性。人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses, HPV）可導致人類宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、肛門癌等惡性病變，目前尚無針對HPV感染后病變或引起惡性癌癥的治療方法。由于病毒的宿主特異性，HPV感染人，不能感染其它動物，這限制了病毒感染動物模型的建立。

2011年印度科學家發(fā)現(xiàn)小鼠乳頭瘤病毒（Mouse papillomavirus type 1, MmuPV1）可感染實驗室小鼠品系，首次為乳頭瘤狀病毒感染小鼠實驗模型制備提供機會。與HPV一樣，MmuPV1也屬于乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬，由閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子組成，其長度為7510bp，含有一條編碼鏈，至少編碼7個ORFs。

乳頭瘤病毒對熱敏感，70℃30分鐘可滅活，但在室溫干燥環(huán)境下3天，病毒活力仍有50%。乙醇、異丙醇、戊二醛、鄰苯二甲醛、苯酚等常用消毒劑均無法殺滅病毒。0.55%次氯酸鈉和1.2%過氧乙酸可滅活病毒。

2.來源

MmuPV1主要由小鼠自身攜帶。

3.發(fā)病機制

MmuPV1感染免疫健全小鼠品系不會引起相應乳頭瘤病，如BALB/c、C57/BL6等；但其感染免疫缺陷小鼠品系時，尤其T細胞缺失小鼠品系可導致乳頭瘤狀增生甚至癌癥，但尚不明確何種T細胞亞群在其中發(fā)揮作用。參與乳頭瘤病毒致癌作用最重要的兩個基因是E6和E7早期基因，與多個靶基因結合后使其功能性失活，從而導致組織器官病變甚至惡性腫瘤。MmuPV1也含有致瘤性的E6和E7基因。

4.流行特征

2011年，印度科學家Ingle A等人首次在T細胞缺陷小鼠NMRI-Foxn1nu/ Foxn1nu裸鼠中分離鑒定得到小鼠乳頭瘤病毒MmuPV1，其病變區(qū)組織病理學分析顯示與PV相關疾病特征一致，即具有PV特異性抗原陽性的空泡細胞乳頭狀突起。該病毒可向未感染部位橫向傳播，并可傳染其他NMRI-FoxN1nu/FoxN1nu裸鼠，以及誘導免疫健全S/RV/Cri-ba/ba小鼠皮膚病理損傷。多個免疫健全小鼠品系感染小鼠乳頭瘤病毒均不會引起乳頭瘤病，只有缺失T細胞的小鼠品系對小鼠乳頭瘤病毒更易感。目前，尚未見對其流行情況的調查研究。

5.臨床表現(xiàn)

MmuPV1感染可引起某些品系小鼠皮膚癌。經紫外線照射的免疫健全或免疫缺陷小鼠品系的皮膚感染MmuPV1后，可產生皮膚疣，甚至癌癥，因此，MmuPV1感染小鼠模型可作為HPV相關皮膚疾病和癌癥進程的首選模型。HPV有關口腔癌在年輕男性中呈現(xiàn)上升趨勢，MmuPV1感染小鼠舌頭、舌根和口咽部等可作為研究HPV相關口腔癌的理想模型。HPV可感染生殖生殖器，并且新生兒復發(fā)性呼吸道乳頭瘤病就是由于HPV感染導致，皮膚感染MmuPV1的小鼠不但可以繼發(fā)感染皮膚，也可繼發(fā)感染粘膜組織。這樣，MmuPV1感染小鼠模型也有助于伴侶間病毒橫向傳播及母嬰垂直傳播研究。

6.培養(yǎng)特性

因為乳頭瘤病毒的生命周期依賴于宿主上皮細胞分化，通過擦傷的上皮細胞或粘膜組織感染宿主從而進入宿主基底層細胞?；讓蛹毎腥竞螅瑵摲轭^瘤病毒導致相關疾病發(fā)生。因此，乳頭瘤病毒的復制過程依賴于角質細胞的分化過程。由于無法在體外實現(xiàn)上皮細胞的分化，所以現(xiàn)在還不能成功體外培養(yǎng)乳頭瘤病毒。MmuPV1可感染T細胞缺失小鼠品系，引起感染部位乳頭瘤狀病變，可用于病毒制備。部分免疫健全品系也可引起乳頭瘤狀病變，也可用于病毒制備及感染同種小鼠品系或其它小鼠品系。

模型背景：

1、小鼠乳頭瘤病毒信息

2011年分離得到的小鼠乳頭狀病毒可感染實驗室小鼠品系，首次提供可用于乳頭瘤狀病毒小鼠模型構制備及相關研究。與HPV一樣，MmuPV1也是環(huán)狀雙鏈DNA，其基因組長度為7510bp，至少編碼7個開放閱讀框（ORFs），基于其在病毒基因組內的保守位置以及與其它乳頭瘤病毒長度相當?shù)腛RF，分別命名為早期編碼區(qū)E1、E2、E4、E6和E7及晚期編碼區(qū)L1和L2。本模型使用小鼠乳頭瘤病毒（the mouse papillomavirus, MmuPV1）為賓夕法尼亞州立大學Jiafen Hu教授友情饋贈。

2、實驗動物背景信息

SPF級6-8周齡NU/NU nude mouse，雌性購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。該品系小鼠來源于NIH，名稱Crl: NU-Foxn1nu，為無毛、白化背景，因攜帶Foxn1nu突變，胸腺發(fā)育不良，不能產生T細胞。

3、研究背景

人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染可引起約5%人類癌癥，包括宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、肛門癌等。現(xiàn)有疫苗可有效預防針對HPV的感染，但目前尚無針對HPV感染后病變或引起惡性腫瘤的有效治療方法，仍需加強相關領域研究。由于HPV感染具有宿主特異性，只能感染人，尚未建立理想的HPV感染動物模型。在病毒嗜性和宿主免疫情況的背景下，構建了數(shù)個HPV參比動物模型，如牛、夠、兔等PV感染模型，但高成本和技術限制了研究的進展。2011年分離得到小鼠乳頭瘤病毒（MmuPV1）可感染實驗室小鼠品系，并引發(fā)小鼠惡性腫瘤，是目前唯一可用于乳頭瘤小鼠感染模型創(chuàng)制的病毒。MmuPV1感染小鼠模型具有動物體積小，易于操作，試劑盒豐富等諸多優(yōu)點。因此，MmuPV1感染小鼠模型為乳頭瘤病毒感染進一步深入研究提供關鍵平臺。

MmuPV1易感動物為T細胞缺陷的小鼠。感染免疫健全小鼠一般不出現(xiàn)臨床癥狀，但可在感染部位檢測到病毒基因組，即使出現(xiàn)乳頭瘤狀增生，均可在一段時間后，清除病毒，即檢測不到病毒基因組。高劑量1×1012 copies MmuPV1感染免疫功能健全的SENCAR小鼠，大部分可在感染部位出現(xiàn)乳頭瘤樣病變，但高劑量1×1012copies MmuPV1感染野生型C57BL/6則無病變產生。