1.評價指標體系

1）心電圖：以“ST段抬高”作為心肌缺血的一個評價指標。當心肌缺血是，ST段抬高，而滴加細顆粒物能夠導致ST段抬高更為顯著，且持續(xù)時間較長。

2）心臟超聲：評價左心室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）和主動脈流出道血流（AV Peak Vel），當上述值降低時，說明左心室功能障礙。

3）心臟TTC染色：TTC 染液能與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，缺血組織內(nèi)呈蒼白色。

4）心肺組織病理HE染色：通過心肺組織病理染色，觀察心肺組織病理性改變和組織結構性改變。

5）心肌損傷標記物：當心肌損傷時心肌損傷標記物：cTnT、CK-MB、LDH顯著升高。

6）血清炎癥因子：檢測血清中炎癥因子：IL-6、TNF-α、MCP-1等炎癥因子，當心肌損傷時而導致炎癥因子增加，而滴注細顆粒物后顯著增加炎癥因子水平。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

目前對于在研究細顆粒物致心血管損傷研究中，Hongyun Wang等通過將雄性C57BL/6J小鼠長期暴露于空氣收集的PM2.5（12小時/天，每周7天，6個月）染毒，成功構建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Chenxu Ge等同樣采用長期暴露（6小時/天，每周5天，6個月）成功構建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Zenghua Qi等人則將C57BL/6J小鼠直接長期飼養(yǎng)暴露于PM2.5中6個月，從而成功構建PM2.5導致的心功能障礙模型。Siqi Wang等人基于ApoE?/?小鼠，通過高脂喂養(yǎng)合并PM2.5氣管滴注（每周1次，共8周），成功構建PM2.5加重動脈粥樣硬化模型。Jun-Jiang Chen等人通過主動脈縮窄術首先構建慢性缺血模型，造模成功后將缺血小鼠暴露在PM2.5濃縮暴露裝置中（6小時/天，5天/周，8周）。可見與單純長期暴露，復合模型能夠縮短造模周期和染毒時間，同時該模型也更符合臨床病理發(fā)展進程。

3. 技術難點

（1）手術難度：本實驗室采用結扎冠狀動脈左前降支構建心肌缺血模型，該手術需要開胸，氣管插管連接呼吸機，還需要在體式顯微鏡下進行操作，具有很大的難度，對操作人員具有很高的要求。

（2）氣管插管：該模型需要多次進行氣管滴注，需要采用非暴露式插管進行染毒。

（3）動物成活率和成模率：本實驗采用兩種因素復合造模，若操作不熟練將會導致死亡率過高，且成模率過低，導致實施難度大

4. 創(chuàng)新性

（1）采用兩種復合因素造模，更好的模擬疾病的病理進程

（2）采用細顆粒物標準品進行染毒，實現(xiàn)通過增強毒力縮短了造模時間。

5. 應用價值

采用氣管滴注復合心肌缺血造模，能很好地模擬細顆粒物加重心血管疾病的疾病環(huán)節(jié)。因此，該模型為研究細顆粒物導致心血管疾病機制研究以及藥效學研究提供了一個已操作、穩(wěn)定可控的動物模型。

動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

3.1心肌缺血手術過程及二導聯(lián)心電圖檢測小鼠心肌缺血時ST段的抬高及DPM 暴露后的影響

結扎冠狀動脈左前降支成功建立小鼠心肌缺血模型。臨床檢測顯示ST段抬高，往往預示著存在急性心肌缺血，甚至心肌梗死，因此本研究選用ST段是否抬高作為評價心肌缺血模型的指標之一。結果顯示：MI 組小鼠 ST 段顯著升高。

MI+DPM復合組ST段升高更為顯著，且呈弓背向上抬高，且持續(xù)抬高時間較長。

圖1 DPM 暴露對心肌缺血時 ST 段的影響（n=12）

Figure 1 Effect of DPM on ST segment of Myocardial ischemia

3.2細顆粒物對心肌缺血小鼠左心室結構相關功能的影響

通過小動物超聲檢測左心室相關指標：左心室射血分數(shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS），結果如圖2所示：與 Sham 組相比，MI 組小鼠LVEF和LVFS顯著降低（P<0.01）；與 MI 組相比，MI+DPM 組LVEF和LVFS持續(xù)下降（P<0.01）。

圖2 DPM 暴露對小鼠心肌缺血后心室結構及功能的影響

Figure 2 Effects of DPM exposure on left ventricular systolic function after myocardial ischemia in mice（n＝12，Mean ± SEM），與Sham組相比，**P＜0.01；與MI組相比，#P＜0.05；##P＜0.01

3.3細顆粒物對心肌缺血小鼠主動脈流出道血流的影響

術后 24 h 后利用小動物超聲檢測小鼠主動脈流出道血流（AV Peak Vel），結果如下表所示：與 Sham 組相比，MI 組小鼠主動脈流出道血流顯著降低（P<0.05）;與 MI 組相比，MI+DPM 組小鼠主動脈流出道血流呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異

表1 DPM 暴露對小鼠心肌缺血后對主動脈流出道血流的影響（n=6）

Table 1 Effects of DPM exposure on aortic valve peak flow velocity aftermyocardial ischemia

與Sham組相比，*P＜0.05；

3.4細顆粒物對心肌缺血小鼠心肌梗死面積的影響

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感復合物，常用于檢測組織缺血性梗塞。TTC 染液是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，能與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內(nèi)由于脫氫酶活性下降，不能反應，故不能產(chǎn)生變化呈蒼白色。見圖 4-3，與假手術組（Sham）相比，心肌缺血組（MI）梗死面積顯著增大；與 MI 組相比，復合模型組（MI+DPM）心肌梗死面積增加。

圖3DPM 暴露對小鼠心肌缺血后心肌梗死面積的影響

Figure 3Effects of DPM exposure on myocardial infarctionarea after myocardial ischemia in mice（n=6，與Sham組相比，**P＜0.01）

3.5細顆粒物對心肌缺血小鼠肺組織病理變化的影響

對各組小鼠肺組織進行 HE 病理染色，結果如圖4所示，Sham 組肺泡壁

較薄，結構完整，無充血及水腫，也無炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。較 Sham 組相比，MI組小鼠肺組織中可見肺泡壁明顯增厚，支氣管管腔結構異常，并伴有大量嗜酸性粘液分泌，肺組織可見明顯的出血癥狀。與 MI 組相比，MI+DPM 復合模型組，出現(xiàn)了肺泡壁的斷裂，支氣管管腔的嗜酸性粘液分泌增多和黑色顆粒物積現(xiàn)象，其余癥狀與 MI 組相比無明顯差異。

圖4 DPM暴露對小鼠心肌缺血后對肺組織病理變化的影響（X400）

Figure 4Effects of DPM exposureon pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.6 細顆粒物對心肌缺血小鼠心肌組織病理變化的影響

心肌組織病理結果如下圖5所示：Sham組小鼠心肌組織結構完整，心肌纖維排列規(guī)則整齊，橫紋清晰，染色均勻，細胞組織間無明顯炎癥細胞浸潤，無組織壞死；與Sham組相比，MI組小鼠心肌纖維部分區(qū)域排列不規(guī)則，可見心肌纖維化，細胞腫大并伴有空泡，胞質(zhì)染色不均勻，細胞間質(zhì)有炎癥細胞浸潤，少量心肌纖維呈點狀壞死，可見胞質(zhì)淡染，核固縮、破裂或溶解消失；與MI相比，MI+DPM組心肌細胞腫脹伴有空泡，可見局灶性組織細胞壞死，局部可見結締組織增生，并伴有大量炎性細胞浸潤。

圖5 DPM暴露對小鼠心肌缺血后對心肌組織病理變化的影響()

Figure 5 Effects of DPM exposure on pathological changes of lung tissue after myocardial ischemia in mice

3.7細顆粒物對心肌缺血小鼠血清心肌損傷標記物影響

結果如圖6所示，與Sham組相比，MI組小鼠血清中的LDH明顯升高（P<0.0001）；與MI相比，MI+DPM組能夠升高血清中LDH的含量（P<0.0001）；與Sham組相比，MI組血清中cTnT和CK-MB無明顯變化；與MI相比，MI+DPM組小鼠血清中cTnT，CK-MB含量急劇升高（P<0.001；P<0.05）。

圖6 DPM暴露對小鼠血清心肌損傷標記物LDH，cTnT，CK-MB的影響

Figure 6 Effects of DPM exposure on LDH and cTnT in serum

注：與Sham組比較，****P＜0.0001；與MI組比較， #P＜0.05； ###P＜0.001； ####P＜0.0001

3.8 細顆粒物對心肌缺血小鼠血清中炎癥因子表達水平的影響

結果如圖7所示：與Sham組相比，MI組小鼠血清IL-6含量顯著升高（P<0.0001）；與MI組相比，MI+DPM組IL-6含量同樣顯著升高（P<0.0001）；

MI組血清中TNF-α與Sham組含量相比有輕微升高，但無統(tǒng)計學差異；與MI相比，復合模型組MI+DPM 中TNF-α含量明顯升高（P<0.0001），與Sham組相比，MI組小鼠血清中MCP-1的含量急劇升高（P<0.0001）；與MI組相比，MI+DPM組含量水平下降（P<0.01）。

圖7 DPM暴露對小鼠血清炎癥指標IL-6，TNF-α，MCP-1的表達水平的影響

Figure 7 Effects of DPM exposure on the expression levels of IL-6, TNF-α and MCP-1 in serum

注：與Sham組比較，****P＜0.0001；與MI組比較， ###P＜0.001； ####P＜0.0001

1實驗材料1.1實驗動物

選擇SPF級C57小鼠，雄性，6-8周齡，體重20-25 g，共48只；由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0011。分籠飼養(yǎng)，每籠5-6只，共9籠。實驗場地由中國中醫(yī)科學院中藥所動物房提供，在SPF級條件下飼養(yǎng)管理，室溫（22±1）℃，相對濕度40%-60%，12 h明暗循環(huán)照明。本研究所有動物實驗相關操作均在中國中醫(yī)科學院動物倫理委員會的批準下進行。

1.2實驗材料

三溴乙醇；叔戊醇；TTC染液；4%多聚甲醛；BCA蛋白定量試劑盒；RIPA裂解液（中）；無水乙醇；二甲苯；HE染液套裝；中性樹膠；IL-6、TNF-α、MCP-1試劑盒

小動物呼吸機（ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司）；實驗用冷光源（F－150C，RWD）；小動物超聲影像系統(tǒng)（VISUALSONICS,Vevo2100）；精細手術剪和手術鑷（德國醫(yī)療器械（集團）有限公司手術器械廠）；體視顯微鏡（OlymPus N2，日本奧林帕斯公司）；1/10萬電子分析天平（BP211D德國Sartorius公司）；多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）數(shù)控超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；qPCR分析儀（qTower-3G；德國耶拿分析儀器股份公司）；萊卡半自動石蠟切片機（RM2245，日本萊卡公司）；萊卡全自動脫水機（AsP200S，日本萊卡公司）；小動物心電圖機（FX-8222T，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）；照相機（EOS-600D，Canon）；正置光學顯微鏡（Nikon EcliPse E100，日本尼康）；Multiskan MK3酶標儀；日立7600全自動生化儀

2實驗方法2.1分組及實驗

C57雄性小鼠按體重隨機分為3組，實驗分組如下：

（1）假手術組（Sham）：0.9%生理鹽水氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周），染毒一周后進行冠狀動脈左前降支只穿線不結扎

（2）模型組（MI）：0.9 %生理鹽水氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/周）后進行冠狀動脈左前降支結扎

（3）復合模型組（MI +DPM）：DPM混懸液氣管滴注1周（1 mg/mL，50 μL/次，2次/week）后進行冠狀動脈左前降支結扎

2.2指標檢測2.2.1肢體二導聯(lián)心電圖檢測

冠狀動脈左前降支LAD結扎術前，連接肢體導聯(lián)心電圖，記錄正常狀態(tài)下心電圖，LAD結扎后1 min內(nèi)，觀察S-T段變化，并記錄二導聯(lián)心電圖。LAD結扎后二導聯(lián)心電圖S-T段明顯抬高，即為造模成功。

2.2.2心臟超聲檢測

手術造模后24 h，采用Vevo 2100小動物超聲儀進行心臟超聲檢查。首先采用三溴乙醇對小鼠進行麻醉，接著小鼠仰臥位固定，在手術備皮處涂抹超聲耦合劑，四肢與生理監(jiān)測電極相連，監(jiān)測心率、呼吸頻率等基礎數(shù)據(jù)并記錄心電圖變化。使用小動物超聲檢測左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）和主動脈瓣最大血流速度（aortic valve Peak flow velocity, AV Peak Vel）。

2.2.3心臟組織TTC染色

將心臟灌流，洗凈多余殘血，用錫紙包裹置于-20 ℃凍存20 min，取出置于心臟模具（提前預冷）中，在結扎線下平行于冠狀溝將心臟切成2 mm厚的切片4片，用濾紙吸去多余水分后，放入預熱的TTC染液中，于37℃恒溫避光振搖染色15 min。正常心肌組織被染為紅色，梗死心肌呈淡白色，染色結束后拍照記錄。用Image J軟件進行圖像分析，測量每片的梗死面積和總面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和即為總的梗死體積。

2.2.4心，肺組織HE病理檢測

心肺組織蘇木精－伊紅（HE）染色

（1）取出已固定的組織，厚度約4mm，放入脫水盒中，做好標記

（2）脫水與透明

（3） 浸潤包埋：透明的組織塊放入其中，迅速冷卻后包埋

（4） 切片、展片和烤片

（5） 石蠟切片脫蠟至水

（6） 蘇木素染色

（7） 伊紅染色

（8） 脫水封片

（9） 在光學顯微鏡下拍照存取圖像，并進行分析

2.2.5血清心肌損傷酶生化指標檢測

于所有處理結束后24 h內(nèi)，小鼠摘眼球取血。靜置2h后，4℃，3000 rpm，離心15 min。取上清，檢測以下指標：乳酸脫氫酶（LDH），按照試劑說明書操作，使用自動生化儀進行測定；肌紅蛋白（cTnT）采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）進行測定。

2.2.6 ELISA檢測血清炎癥指標IL-6，TNF-α，MCP-1的表達水平

小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1含量均采用ELISA檢測試劑盒檢測，按照試劑盒說明書操作。

2.3數(shù)據(jù)分析

實驗結果以均數(shù)±標準誤（Mean ± SEM）表示，使用GraphPad Prism 8軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），組間差異的比較用Dunnett's Multiple Comparison檢驗；當P< 0.05時判定兩組間具有顯著性差異。

1.目的

在醫(yī)學研究中，選擇合適的動物模型至關重要，目前已有很多公認的心血管疾病動物模型和細顆粒物（PM）暴露動物模型。目前大多數(shù)研究主要以單疾病研究為主，但單一因素的模型不適宜去研究PM2.5加重心血管疾病的潛在機制的探究，在研究復雜疾病中有較大的局限性。當前推薦使用復合模型可以更好地模擬實際情況，因此本模型將氣管滴注細顆粒物染毒和心肌缺血模型結合，有利于探究PM2.5增加心血管事件的潛在機制。

2. 意義

細顆粒物（fine particulate matter;PM2.5）目前作為心血管疾病一個公認的危險因素。大量流行病學研究表明 PM2.5長期暴露能夠促進冠狀動脈鈣化灶的形成，加速動脈粥樣硬化的進程[1]；能增加高血壓發(fā)病率[2, 3]；加快糖尿病病變進程[4]。一項基于我國12萬成年人平均隨訪8年的前瞻性研究顯示，PM2.5年均暴露濃度每增加10μg/m3，冠心病風險增加43%[5]。但目前PM2.5增加心血管事件的潛在介質(zhì)尚不完全清楚。在探索機制的過程，選擇合適的動物模型至關重要。

3. 國內(nèi)外研究進展

小鼠繁殖力強、易于飼養(yǎng)、價格低廉、占用空間少、操作簡便，品系多樣使其可根據(jù)研究目的建立復合模型，且小鼠基因在一定程度與人類基因同源性強，因此我們選擇小鼠為模型建立的對象。小鼠心肌梗死模型的制作方法有藥物法、微創(chuàng)法、電刺激法、冷凍法、冠狀動脈左前降支結扎法等，其中冠狀動脈左前降支結扎法最為經(jīng)典和常用。這種方法可直接造成左心室前降支堵塞，與臨床中的心肌梗死原理貼近，試驗周期短，可以觀察梗死后對心肌的損害。

細顆粒物體內(nèi)毒性作用研究實驗中，常用的三種染毒方式為氣管滴注染毒、尾靜脈注射染毒和全身自由暴露法染毒。其中全身自由暴露染毒對暴露設施儀器有較高要求，實施難度較大，尾靜脈注射染毒不能夠完全模擬細顆粒物經(jīng)氣道進入人體的過程，因此與事實最相符、最常用的方法是氣管滴注染毒。

目前對于在研究細顆粒物致心血管損傷研究中，Hongyun Wang[6]等通過將雄性C57BL/6J小鼠長期暴露于空氣收集的PM2.5（12小時/天，每周7天，6個月）染毒，成功構建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Chenxu Ge[7]等同樣采用長期暴露（6小時/天，每周5天，6個月）成功構建PM2.5誘發(fā)的心肺損傷模型。Zenghua Qi[8]等人則將C57BL/6J小鼠直接長期飼養(yǎng)暴露于PM2.5中6個月，從而成功構建PM2.5導致的心功能障礙模型。Siqi Wang[9]等人基于ApoE?/?小鼠，通過高脂喂養(yǎng)合并PM2.5氣管滴注（每周1次，共8周），成功構建PM2.5加重動脈粥樣硬化模型。Jun-Jiang Chen[10]等人通過主動脈縮窄術首先構建慢性缺血模型，造模成功后將缺血小鼠暴露在PM2.5濃縮暴露裝置中（6小時/天，5天/周，8周）。可見與單純長期暴露，復合模型能夠縮短造模周期和染毒時間，同時該模型也更符合臨床病理發(fā)展進程。

本研究團隊綜合了本實驗室具體情況，在沒有全身暴露裝置以及縮短造模時長前提下優(yōu)化造模方式，選擇了細顆粒物標準品為染毒物品，該標準品來源于柴油顆粒物，主要由多環(huán)芳烴(PAHs)和硝基取代的多環(huán)芳烴(硝基-PAHs)組成。PAHs是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的一類持久性有機污染物，其結構穩(wěn)定，可在大氣、水體、沉積物、灰塵等多種環(huán)境介質(zhì)中長期存在，具有半揮發(fā)性特性，由環(huán)境中各種燃料的不完全燃燒產(chǎn)生。多環(huán)芳烴中的代表苯并（a）芘，具有強致癌作用。因此本方法采用毒性更強，物質(zhì)更確定的細顆粒物標準品混懸液進行氣管滴注，既能解決實驗設施弊端，又能縮短造模周期。

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