用于構(gòu)建模擬人類帕金森病患者PINK1與DJ-1基因功能缺失突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的成年獼猴帕金森病模型，對于帕金森病的病因、發(fā)病機(jī)制以及診斷標(biāo)志物發(fā)掘具有重要的參考價值。

動物模型制備過程中的監(jiān)督管理、處置措施、微生物菌株檢測、對環(huán)境和生態(tài)影響的評估等由中國科學(xué)院昆明動物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一管理。建模過程中未見動物出現(xiàn)感染與毒性反應(yīng)等。

1基因編輯獼猴多巴胺能系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷并出現(xiàn)精細(xì)運(yùn)動障礙

經(jīng)典PD癥狀評估之后，我們進(jìn)行了藥理學(xué)驗(yàn)證，通過經(jīng)典藥理旋轉(zhuǎn)范式評價PD相關(guān)的多巴胺功能缺陷。本實(shí)驗(yàn)中，獼猴進(jìn)行阿撲嗎啡（Apo，一種多巴胺D1受體激動劑）誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測試。在受損側(cè)紋狀體的突觸后多巴胺受體總是比健康側(cè)的突觸后多巴胺受體對Apo更敏感，這種不平衡將導(dǎo)致獼猴在接受Apo注射后轉(zhuǎn)向健康側(cè)。在病毒注射后，給予Apo之前，由于基因編輯對黑質(zhì)多巴胺能系統(tǒng)的損傷，獼猴緩慢發(fā)展為向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)的趨勢（圖1 A）。給予Apo后，旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)為健康側(cè)（圖1 B）。表明基因編輯后獼猴腦中PD相關(guān)的多巴胺系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷。

PD患者另一個行為異常是精細(xì)運(yùn)動障礙。我們通過訓(xùn)練獼猴抓取食物進(jìn)行測量。根據(jù)獼猴的利手偏好選擇損傷黑質(zhì)的哪一側(cè)：1號中年獼猴和1號老年獼猴都是100%的右利手，所以我們將PINK1和DJ-1的AAV9s-sgRNA-Cas9注射到它們左側(cè)黑質(zhì)。相反，2號中年獼猴和2號老年獼猴基本都是左利手，我們對其右側(cè)黑質(zhì)進(jìn)行基因編輯。病毒注射后，4只獼猴中3只在食物抓取中改變了利手（圖1 C），它們無法使用以前的利手獲取食物，不得不使用非利手。只有1號老年獼猴保持其手的偏好，但是，其取食的潛伏期顯著增加（圖1 D），準(zhǔn)確度沒有變化（圖1 E），表明這只獼猴精細(xì)運(yùn)動障礙較輕。

圖1 阿撲嗎啡（Apo）誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測試和取食任務(wù)驗(yàn)證偏側(cè)黑質(zhì)基因編輯獼猴模型的多巴胺功能障礙和精細(xì)運(yùn)動技能損傷。（A）基因編輯后，獼猴向損傷側(cè)自發(fā)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增多。（B）基因編輯后，Apo誘導(dǎo)獼猴向健康側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增多。（C）1號老年獼猴除外，另外三只獼猴在注射病毒后改變了它們利手偏好。（D）基因編輯后，1號老年獼猴在取食任務(wù)中的潛伏期顯著增加。（E）1號老年獼猴在取食任務(wù)中的準(zhǔn)確率與基線相比沒有顯著變化。（A-B）和（D-E）的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

總之，通過AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)共同編輯成年獼猴偏側(cè)黑質(zhì)的PINK1和DJ-1基因可導(dǎo)致PD典型的運(yùn)動癥狀并得到藥理學(xué)與精細(xì)運(yùn)動能力測試驗(yàn)證。

2 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的病理驗(yàn)證

首先需排除對照側(cè)病毒注射對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響。我們發(fā)現(xiàn)兩只基因編輯獼猴對照側(cè)的多巴胺能神經(jīng)元與我們以前的研究中的兩只年齡匹配的對照獼猴（沒有任何手術(shù)的正常對照）相比，無論是細(xì)胞形態(tài)還是細(xì)胞數(shù)量都沒有顯著差異，表明AAV9注射劑和AAV9-SaCas9-SgControl不會對SNs造成任何明顯的損傷。

其次，為了驗(yàn)證細(xì)胞計數(shù)方法的可靠性，對于SNpc中多巴胺能神經(jīng)元的總數(shù)，我們采用Garcia等和Gundersen等使用的方法估算。結(jié)果表明，基因編輯獼猴對照側(cè)SNpc神經(jīng)元的平均總數(shù)約14800，與之前的報道一致（約14500），表明該計數(shù)方法是可靠的。黑質(zhì)PSer129αS聚集計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)陽性染色信號則進(jìn)行統(tǒng)計。

3 病毒轉(zhuǎn)染和基因編輯的結(jié)果驗(yàn)證

我們通過EGFP陽性神經(jīng)元Paris水平來衡量PINK1/Parkin通路的功能。若PINK1功能缺失，其關(guān)鍵底物Paris/ZNF746的表達(dá)上升。結(jié)果顯示，與EGFP陰性神經(jīng)元相比，Paris/ZNF746的表達(dá)量在AAV9-CRISPR/Cas9基因編輯獼猴（2號中年獼猴）的SN區(qū)域顯著增加（圖2 AB）。不僅驗(yàn)證了AAV成功轉(zhuǎn)染了神經(jīng)元，還導(dǎo)致了PINK1/Parkin通路功能缺失，即Paris上調(diào)，與人類PD腦病理一致。同時，我們檢測了DJ-1蛋白在EGFP陽性神經(jīng)元中的表達(dá)，并與基因編輯側(cè)SN附近的EGFP陰性神經(jīng)元進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)DJ-1顯著下調(diào)（圖2 CD）。綜上，黑質(zhì)AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)致PINK1和DJ-1功能下調(diào)，可能共同誘發(fā)獼猴PD發(fā)生。

圖2 PINK1與DJ-1表達(dá)水平改變的免疫熒光圖像與定量。（A）EGFP陰性或EGFP陽性神經(jīng)元（NeuN+）中可見Paris（紅色）熒光強(qiáng)度信號。（B）EGFP陽性神經(jīng)元中Paris的熒光強(qiáng)度顯著增加（EGFP陰性神經(jīng)元：N=18；EGFP陽性神經(jīng)元：N=30，P<0.001），是PINK1功能下調(diào)的可靠標(biāo)志物，已在PD患者中得到證實(shí)。（C）EGFP陰性或陽性神經(jīng)元（NeuN+）獲得的DJ-1（紅色）熒光強(qiáng)度信號。（D）EGFP陽性細(xì)胞中DJ-1的熒光強(qiáng)度顯著降低（EGFP陰性神經(jīng)元：N=24；EGFP陽性神經(jīng)元：N=24，P<0.001）。比例尺：白色：100 μm，黃色：20 μm。B和D的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

4 基因編輯對獼猴黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的影響

為了解析病毒注射引起膠質(zhì)細(xì)胞激活引發(fā)的炎癥是否導(dǎo)致PD發(fā)生，我們首先檢測了黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是否被黑質(zhì)EGFP+區(qū)域的病毒轉(zhuǎn)染與激活（圖3 A）。與基因編輯的SN中EGFP-區(qū)域相比（圖3 B），我們發(fā)現(xiàn)GFAP+細(xì)胞和Iba1+細(xì)胞都未與EGFP信號共表達(dá)，表明膠質(zhì)細(xì)胞未被病毒轉(zhuǎn)染。此外，膠質(zhì)細(xì)胞沒有明顯的形態(tài)變化（圖3 AB）。計數(shù)表明，與EGFP-區(qū)相比，SN中EGFP+區(qū)GFAP+和Iba1+細(xì)胞數(shù)量均無顯著增加（圖3 CD），表明AAV9介導(dǎo)的基因編輯過程中膠質(zhì)細(xì)胞沒有增生。

圖3 基因編輯側(cè)黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光圖像與定量。（A）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，EGFP+陽性神經(jīng)元附近星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP+細(xì)胞）和小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba1+細(xì)胞）的免疫熒光染色圖像。（B）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，未表達(dá)EGFP附近（對照），即EGFP-附近星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色圖像。

（C）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP+細(xì)胞）數(shù)量沒有顯著增加（P=0.687）。（D）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba1+細(xì)胞）數(shù)量也未見顯著增加（P=0.066）。比例尺：40 μm；C和D的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

1實(shí)驗(yàn)動物和倫理

實(shí)驗(yàn)方案和動物福利均獲得中國科學(xué)院昆明動物研究所倫理委員會的批準(zhǔn)（IACUC No.15001）。獼猴單籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)的明/暗周期，自由取食飲水并由獸醫(yī)照看。10只雄性成年獼猴參與PD建模。其中，4只用于初步研究，嘗試單獨(dú)編輯PINK1（n=2，90067，95301）或DJ-1基因（n=2，95075，97081）；另4只用于PINK1與DJ-1基因的共同編輯（n=4，070229，070209，94089，97093）；其余2只獼猴是年齡匹配的對照（n=2，99357，91097），用于比較TH免疫組化染色結(jié)果。

2病毒載體構(gòu)建和突變效率檢測

AAV9-SaCas9載體從Addgene（＃61593）獲得并在COS7細(xì)胞系進(jìn)行突變檢測。我們構(gòu)建的sgRNA-PINK1-A、sgRNA-PINK1-B、sgRNA-DJ-1-A和sgRNA-DJ-1-B均在COS7細(xì)胞的PINK1與DJ-1蛋白編碼區(qū)引起錯義突變。

3 MRI指導(dǎo)的黑質(zhì)（substantia nigra, SN）精準(zhǔn)定位和病毒注射

獼猴腦黑質(zhì)（SN）的準(zhǔn)確定位（誤差<1 mm）是實(shí)現(xiàn)AVV基因編輯有效性的先決條件，需要通過精準(zhǔn)注射AVV成功轉(zhuǎn)染大范圍的SN。獼猴肌注阿托品（0.5 mg/mL，1ml，i.m.，Handu，中國新鄭），10分鐘后肌注氯胺酮（1.0-1.5 ml，0.1 g/2 ml，i.m.，中國臺州中牟）麻醉獼猴，然后肌注戊巴比妥鈉（40 mg/mL，20 mg/kg，i.m.，F(xiàn)luka，德國）維持深度麻醉。

為了使AVV轉(zhuǎn)染范圍最大限度覆蓋獼猴SN，我們添加了兩個具有相同參數(shù)的注射平面，分別位于SN最大面積平面的前后，間隔2 mm。因此，SN注射共有三個平行的冠狀平面。病毒注射共設(shè)6個點(diǎn)，每個注射點(diǎn)間隔1 mm（每條路徑總劑量50 μL）。同一SN的相鄰兩條路徑注射以相同的方式進(jìn)行。三個平行注射路徑共150 μL的病毒，獼猴的對側(cè)黑質(zhì)為對照，注射不含基因編輯元件的AAV。我們通過注射泵（World Precision Instruments，Inc.，UMP 3-4，USA）維持病毒注射速度為800 nL/min。之后，縫合傷口。獼猴每天肌注80萬單位青霉素防止感染，持續(xù)一周。

4行為數(shù)據(jù)的收集和分析

1）我們通過數(shù)碼相機(jī)（Sony HDR-XR260，日本）收集每只獼猴行為的錄像。在上午10：00-11：00，位于籠子前方1米處的照相機(jī)在沒有外部干擾的情況下記錄單籠獼猴行為1小時。實(shí)驗(yàn)期共收集日常行為數(shù)據(jù)七次，分別在第0周（基線），術(shù)后第6、10、12、14、16和18周的每周三上午進(jìn)行。

2）為了檢測基因編輯對黑質(zhì)-紋狀體多巴胺功能的影響，我們采用Apo誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)進(jìn)行評估。首先，在1小時的視頻中，從第15分鐘到第45分鐘的30分鐘內(nèi)，對每只獼猴的自發(fā)旋轉(zhuǎn)計數(shù)。其次，獼猴注射Apo 10分鐘后，拍攝一段新的1小時視頻。同樣從第15分鐘到第45分鐘的30分鐘進(jìn)行旋轉(zhuǎn)計數(shù)。在肌肉注射前5分鐘，將2 mg的Apo溶解于2 mL（1 mg/mL）的維生素C溶液（0.5 mg/2 mL）。在第0周（基線）、術(shù)后第6周、第10周、第12周、第14周的每周三日常行為錄像后分別進(jìn)行5次旋轉(zhuǎn)行為測試。

3）為了研究獼猴在PD發(fā)展過程中的精細(xì)運(yùn)動障礙，我們進(jìn)行了食物抓取測試。獼猴需要從籠子前面的食物盒內(nèi)拿一塊食物作為獎勵。抓取行為穩(wěn)定后，收集基線數(shù)據(jù)，記錄抓取食物的潛伏期、正確率和利手偏好。每只獼猴須在每個測試周的三天內(nèi)完成180次測試（每天60次）。獼猴分別于第0周（基線）、術(shù)后第6周、第10周、第12周、第14周測試五次。

5 PD病理特征染色

1）TH染色：獼猴雙側(cè)SN的冠狀切片用3% H2O2（5 min）、3% triton X-100（4 min，中國北京索萊寶）和羊血清（15 min，中國福州邁新）處理，兔抗TH抗體（1:1000，AB152，Millipore）4 °C過夜。次日，將切片與二抗（PV-9000，30 min，中國北京中杉金橋）37 °C孵育。之后，切片DAB顯色2 min（DAB-1031Kit，20×，中國福州邁新），蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。

2）PSer129αS染色：切片用10 μM/ mL蛋白酶K（中國上海阿拉丁）在10 mM Tris-HCl，pH=7.8、100 mM NaCl，0.1％Tween-20（Bio-Rad，美國）37°C處理30 min。之后切片用3％H2O2（5 min，中國福州邁新）、3％Triton X-100（4 min，中國北京索萊寶），10％羊血清處理（15 min，中國福州邁新），經(jīng)典的兔抗PSer129αS多克隆抗體（1：100，ab59264，Abcam，美國）4°C過夜。次日切片與抗兔/小鼠二抗試劑盒（PV 9000，中國北京中杉金橋）37°C孵育30 min。之后，切片DAB顯色2 min（DAB-1031Kit，20×，中國福州邁新），蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。

染色后，所有切片用乙醇梯度脫水并用二甲苯透明。中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡（奧林匹斯，CX41；照相機(jī)：奧林匹斯DP25；軟件：cellSens Entry 1.4.1；日本）采集照片。因大多數(shù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元位于黑質(zhì)致密部，我們在4×物鏡（3.5 mm × 2.6 mm）、20×物鏡（690.8 μm × 518.1 μm）和40×物鏡（345.4 μm × 259 μm）下鑒定典型的細(xì)胞形態(tài)并以第三對腦神經(jīng)3n為參考，選定黑質(zhì)長軸近中心區(qū)域用于細(xì)胞計數(shù)。

通過ImageJ軟件（National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）在40×物鏡下對計數(shù)區(qū)域的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元（TH陽性染色細(xì)胞）計數(shù)，分別獲得獼猴對照側(cè)和基因編輯側(cè)的平均細(xì)胞密度（個數(shù)/mm2），進(jìn)行統(tǒng)計。

6基因編輯效果驗(yàn)證的共聚焦成像和數(shù)據(jù)量化

通過Nikon A1共聚焦顯微鏡獲取z-stack圖像。分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑質(zhì)細(xì)胞的Paris的熒光強(qiáng)度用于定量PINK1的表達(dá)水平，以及分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑質(zhì)細(xì)胞DJ-1的熒光強(qiáng)度，量化DJ-1的表達(dá)水平。