病毒滅活試驗和病毒殺滅試驗方法詳解
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健明迪檢測提供的病毒滅活試驗和病毒殺滅試驗方法詳解，新冠病毒滅活試驗：結果評價 同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格： a)去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗合格； b)懸液滅活試驗，具有CMA,CNAS認證資質。
新冠病毒滅活試驗：結果評價
同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：
a) 去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗合格；
b) 懸液滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥5.0或載體滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥4.0。
更多新冠病毒滅活試驗的相關問題，請點擊右側在線咨詢，健明迪檢測客服將為您分配對應工程師，為您提供更專業的咨詢。
新冠病毒滅活試驗：試驗步驟
新冠病毒滅活試驗原理，是用細胞感染法測定消毒因子作用前后（或對照組與實驗組）樣本中病毒的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對新型冠狀病毒的滅活效果。
1、懸液法病毒滅活試驗
a) 取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機干擾物按照 1:1 比例混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
c) 消毒試驗：取上述病毒懸液1份加入4份待檢消毒劑，立即混勻并記時。作用至規定時間，立即取出 0.1 mL，加入經鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經鑒定合格的除藥方法處理。
d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續放入二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
2、載體法病毒滅活試驗
a) 取待測消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。
c) 消毒試驗：取病毒載體置于消毒因子，作用至規定的時間后取出放入經鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點應置于最難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術規范》。
d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
新冠病毒滅活試驗：中和劑鑒定試驗
鑒定試驗旨在確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。中和劑鑒定試驗包括預試驗和正式試驗，通過預試驗確定消毒劑、中和產物和中和劑等對細胞生長有無影響；通過所設各組試驗結果綜合分析，確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響；中和試驗用消毒劑濃度應為正式消毒試驗最高濃度，作用時間最短不得少于30 s。試驗重復3次。
新冠病毒滅活試驗：載體的制備
1、載體應根據消毒對象選擇相應的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質的載體。
2、所用載體于染病毒前，應進行脫脂處理。脫脂過程應嚴格按照如下步驟進行：
a) 將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;
b) 用自來水漂洗；
c) 用蒸餾水煮沸 10 min；
d) 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；
e) 晾干，備用。
3、載體經壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗前使用滴染法染病毒懸液。
4、滴染載體的病毒滴度對數值應≥4.0。
新冠病毒滅活試驗：細胞準備
實驗所用Vero- E6細胞或其它細胞在細胞培養室常規傳代培養，置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養至單層細胞備用。
新冠病毒滅活試驗：病毒懸液的制備
取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設定濃度的有機干擾物混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
新冠病毒滅活試驗：試驗器材
1、試驗病毒與細胞
試驗病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養物，細胞株為非洲綠猴腎傳代細胞（VeroE6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養的細胞系。
2、有機干擾物
牛血清白蛋白。
3、試劑
消毒因子、中和劑、細胞消化液、細胞維持液和細胞培養液等。
4、儀器
二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級或 II 級以上生物安全柜等。
5、耗材
無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細胞培養板、單道移液器、多道移液器等。
6、載體
可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。
健明迪檢測是獨立第三方檢測機構，具備開展病毒殺滅試驗的生物安全等級2級（P2）實驗室，可開展消毒器械、消毒劑、抗菌材料等產品的病毒滅活驗證試驗，歡迎預約參觀實驗室。
本文詳細介紹了新冠病毒滅活試驗的具體方法和步驟。
同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：
a) 去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗合格；
b) 懸液滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥5.0或載體滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數值應≥4.0。
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新冠病毒滅活試驗：試驗步驟
新冠病毒滅活試驗原理，是用細胞感染法測定消毒因子作用前后（或對照組與實驗組）樣本中病毒的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對新型冠狀病毒的滅活效果。
1、懸液法病毒滅活試驗
a) 取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機干擾物按照 1:1 比例混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
c) 消毒試驗：取上述病毒懸液1份加入4份待檢消毒劑，立即混勻并記時。作用至規定時間，立即取出 0.1 mL，加入經鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經鑒定合格的除藥方法處理。
d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續放入二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
2、載體法病毒滅活試驗
a) 取待測消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。
c) 消毒試驗：取病毒載體置于消毒因子，作用至規定的時間后取出放入經鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點應置于最難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術規范》。
d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。
f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養板，更換細胞維持液。繼續二氧化碳培養箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，記錄細胞病變情況。
新冠病毒滅活試驗：中和劑鑒定試驗
鑒定試驗旨在確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。中和劑鑒定試驗包括預試驗和正式試驗，通過預試驗確定消毒劑、中和產物和中和劑等對細胞生長有無影響；通過所設各組試驗結果綜合分析，確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響；中和試驗用消毒劑濃度應為正式消毒試驗最高濃度，作用時間最短不得少于30 s。試驗重復3次。
新冠病毒滅活試驗：載體的制備
1、載體應根據消毒對象選擇相應的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質的載體。
2、所用載體于染病毒前，應進行脫脂處理。脫脂過程應嚴格按照如下步驟進行：
a) 將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;
b) 用自來水漂洗；
c) 用蒸餾水煮沸 10 min；
d) 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；
e) 晾干，備用。
3、載體經壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗前使用滴染法染病毒懸液。
4、滴染載體的病毒滴度對數值應≥4.0。
新冠病毒滅活試驗：細胞準備
實驗所用Vero- E6細胞或其它細胞在細胞培養室常規傳代培養，置二氧化碳培養箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養至單層細胞備用。
新冠病毒滅活試驗：病毒懸液的制備
取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設定濃度的有機干擾物混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。
新冠病毒滅活試驗：試驗器材
1、試驗病毒與細胞
試驗病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養物，細胞株為非洲綠猴腎傳代細胞（VeroE6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養的細胞系。
2、有機干擾物
牛血清白蛋白。
3、試劑
消毒因子、中和劑、細胞消化液、細胞維持液和細胞培養液等。
4、儀器
二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級或 II 級以上生物安全柜等。
5、耗材
無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細胞培養板、單道移液器、多道移液器等。
6、載體
可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。
健明迪檢測是獨立第三方檢測機構，具備開展病毒殺滅試驗的生物安全等級2級（P2）實驗室，可開展消毒器械、消毒劑、抗菌材料等產品的病毒滅活驗證試驗，歡迎預約參觀實驗室。
本文詳細介紹了新冠病毒滅活試驗的具體方法和步驟。
